Preparación y estabilidad del ligando DMSA y de los radiofármacos M-DMSA

Ligando DMSA

El DMSA se obtiene mediante una síntesis simple, que consiste en la reacción del ácido succínico con 2 moles de ácido tiolacético en presencia de acetato de etilo, donde se obtiene un precipitado en forma de mezcla de estereoisómeros del ácido bisacetiltiosuccínico (-meso y la mezcla racémica -DL), luego este precipitado se lava con ácido clorhídrico para producir la hidrólisis y obtener finalmente el ácido dimercaptosuccínico {ref[36}. Desde finales de los años 70 del pasado siglo, el DMSA es un producto distribuido comercialmente en su forma -meso para su aplicación en la medicina.

Los grupos SH que presenta la molécula de DMSA pueden ser fácilmente oxidados, formando estructuras dimerizadas ^(14,31,52). Además, mediante técnicas espectroscópicas (RMN-¹H, RMN-¹³C y UV-Vis) se demostró que el DMSA se degrada en el tiempo fundamentalmente a pH alcalino ⁽⁵³⁾, por procesos de desulfuración convirtiendo la molécula en ácido fumárico (su principal producto de degradación), alcanzando pasada tres semanas una relación (DMSA : ácido fumárico) (1:1). Estos productos pueden considerarse potenciales agentes quelantes y junto al ^99mTc pueden incrementar la presencia de impurezas radioquímicas en el preparado del radiofármaco ⁽¹⁵⁾. La estabilidad del DMSA está relacionada con sus condiciones de almacenamiento, se recomienda conservarse protegido de la luz y en atmósfera de dinitrógeno a -20 ºC.

Radiofármaco 99mTc(V)-DMSA

Uno de los factores que influyen en la preparación de los radiofármacos M-DMSA es el pH del medio. A pH básico, el DMSA se une al ^99mTc en estado de oxidación (V), y se forma un compuesto empleado para la detección de tumores (carcinoma medular de tiroides fundamentalmente) y a pH ácido el DMSA se une a ^99mTc en estado de oxidación (III), y se forma un compuesto empleado para estudios estáticos de gammagrafía de corteza renal. Durante este proceso puede verse comprometida la estabilidad de la molécula de DMSA, fundamentalmente a pH básico, pudiendo provocar su degradación. Además, se pueden formar compuestos secundarios, como el Sn(DMSA)₂, que alteran las propiedades biológicas del radiofármaco ⁽¹⁷⁾.

Estudios mediante técnicas analíticas (electroforesis y HPLC) demostraron la influencia del pH del medio de preparación en la obtención del complejo de Tc(V)-DMSA, mezcla de tres estereoisómeros en medio alcalino, y el Tc(III)-DMSA, obtenido bajo condiciones de pH ácido ⁽⁵⁴⁾. Estos estudios sugieren también la posibilidad de formar cinco tipos diferentes de complejos con DMSA en dependencia del pH y de la relación de concentración de DMSA : SnCl₂*2H₂O, los cuáles pueden tener diferente biodistribución ⁽¹⁵⁾. Estudios más recientes sugieren que el factor determinante en la obtención de uno u otro complejo de ^99mTc-DMSA (III o V) es la concentración de ^99mTc durante el proceso de preparación y no la influencia del pH ⁽¹⁷⁾.

La preparación de ^99mTc(V)-DMSA ocurre en condiciones de pH alcalino de manera espontánea y a temperatura ambiente (Tabla 1) ⁽⁵⁵⁾. Numerosos estudios se centran en partir del kit comercial de ^99mTc(III)-DMSA al elevar el pH mediante la adición de una pequeña cantidad de NaHCO₃, para alcanzar las condiciones adecuadas de obtención del ^99mTc(V) por reducción del pertecnectato (^99mTcO₄^-) ^{(14,55,56,57,58)}.

Un factor a considerar en la estabilidad es el pH del medio, ya que a valores por encima de 8.8 se ha encontrado la presencia del complejo Sn(DMSA)₂, favorecido en ocasiones por la relación molar de partida (DMSA: SnCl₂*2H₂O) (3:1) presentes en los kit comerciales. Además, es importante tener en cuenta la inestabilidad de la molécula de DMSA en condiciones de pH alcalino ⁽¹⁵⁾.

Tabla 1. Principales parámetros de la preparación de los complejos M-DMSA ^{(8,9,17,23,28,59,60,61)}.

Componentes del kit y parámetros de reconstitución	99mTc(V)-DMSA*	186/188Re(V)-DMSA*	99mTc(III)-DMSA
DMSA	1 mg/mL	1 mg/mL	1 mg/mL
SnCl2*H2O	0.33 mg/mL	0.44 mg/mL	0.33-0.41 mg/mL
Buffer Bicarbonato, 4.4%, pH9.0	1 mL	ajustar pH a 7.5 – 8.0	No contiene
Ácido ascórbico	No contiene	0.70 mg/mL	0.75 - 1 mg/mL
NaCl	No contiene	No contiene	3 – 5 mg/mL
Volumen 99mTcO4-	2 mL (máximo 30 mCi o 1.11 MBq)	1 mL (16 MBq)	3 mL (máximo 100 mCi o 3.7 GBq)
Tiempo de incubación	15 - 20 min	30 min (100 ºC)	15 - 20 min
pH al reconstituir el bulbo	8 – 9	1.5 – 2.5	2.3 – 3.5
Plazo de validez	hasta 4 h	hasta 4 h	hasta 4 h

*La preparación se realiza a partir del kit comercial de ^99mTc(III)-DMSA.

Radiofármaco ^186/188Re(V)-DMSA

En general los complejos de Re son más difícil de reducir y cinéticamente más inertes a la reacción de sustitución de ligandos, que sus análogos de Tc. Estas diferencias se evidencian en las condiciones de preparación que requieren ambos complejos. En la preparación de ^186/188Re(V)-DMSA (Tabla 3) no es necesario elevar el pH del kit, debido a que la reducción del perrenato (^186/188ReO₄^-) es factible hasta el Re(V) en condiciones de pH bajo. Para alcanzar estados de oxidación inferiores del Re se necesita un mayor poder de reducción en otras condiciones del medio. Mientras los complejos de Tc(V)-DMSA se forman espontáneamente a temperatura ambiente, en la preparación del ^186/188Re(V)-DMSA es necesario la incubación durante 30 minutos y temperatura de 100 oC. En caso de la preparación del radiofármaco con el radionúclido ¹⁸⁶Re, se debe tener en cuenta la presencia de portadores (¹⁸⁵Re estable que actúa de blanco en la reacción n,γ), por lo que al proceso de preparación le debe seguir un proceso de purificación donde se garantice obtener el radiofármaco libre de portadores con la mayor actividad específica posible. Bisunadan et al. ⁽⁹⁾ en 1991 propusieron un método para la purificación de este radiofármaco.

Lisic et al. ⁽⁶²⁾ reportaron otra ruta para la síntesis del complejo Re(V)-DMSA usando el radionúclido ¹⁸⁸Re libre de portador. La síntesis consiste en la preparación de ReOCl₃(PPh₃)2 obtenido con más de 95% de rendimiento, mediante la reacción del perrenato (¹⁸⁸ReO₄^-) con trifenilfosfina (PPh₃) y HCl con la subsecuente extracción con CH₂Cl₂ o CHCl₃. En la reacción de ReOCl₃(PPh₃)₂ con DMSA a temperatura ambiente ocurre el intercambio de ligando donde se forma ReO(DMSA)₂ con alto rendimiento y químicamente idéntico al compuesto preparado usando el agente reductor SnCl₂ {ref[51}.

Estudios más recientes ^(11,63,64) reflejan la posibilidad de preparar el radiofármaco sin necesidad de elevar la temperatura y adicionando oxalato de sodio al kit. La ventaja fundamental de este método consiste en que se logra una reducción de ¹⁸⁸ReO₄^- más eficiente. El método consiste en la presencia de ligandos auxiliares adicionales, los cuales deben jugar un papel de quelato bifuncional enlazando al ¹⁸⁸ReO₄^- y a una molécula anfitriona apropiada en presencia del reductor Sn²⁺, los cuales forman una especie intermedia para finalmente obtener el complejo deseado mediante reacción de intercambio con el ligando de interés. Mediante este mecanismo se logra la expansión de la esfera de coordinación del núcleo metálico ¹⁸⁸Re lo que favorece fuertemente a la transferencia electrónica entre el par redox Sn²⁺/ ReO₄^{- (11)}.

En la estabilidad del radiofármaco ^186/188Re(V)-DMSA influye de manera significativa los procesos de auto-radiólisis que pueden tener lugar en el preparado. Actividades adecuadas (16 MBq por vial) del radionúclido garantiza la estabilidad del producto con alta pureza radioquímica. En caso de actividades elevadas (185 MBq por vial), el complejo sufre una severa auto-radiólisis, lo que disminuye la pureza radioquímica del radiofármaco. Para atenuar estos efectos se añaden 15 mg de ácido ascórbico por vial, la presencia de este componente no afecta la composición isomérica del ^186/188Re(V)-DMSA ⁽⁸⁾.

Radiofármaco ^99mTc^(III)-DMSA

Ikeda et al. ^(67,68) encontraron que el Tc puede formar cuatro complejos diferentes con DMSA: (I) Tc(IV)-DMSA, (II) Tc(III)-DMSA, (III) Tc(V)-DMSA y (IV) Tc(VI)-DMSA. La formación de estos complejos depende del pH, la concentración de pertecnectato, y la relación Sn(II) / Sn(IV). Los complejos I y II se forman a pH bajo y los complejos III y IV a pH alto. Mediciones espectrofotométricas y estudios de titulación estequiométricos de la solución del pertecnectato-DMSA con SnCl₂ mostraron que el complejo I fue formado espontáneamente y se identificó como ^99mTc(IV)-DMSA. Estudios biológicos de localización revelaron que el complejo I se localiza en hueso y fue excretado en la orina con poca retención del riñón. Además, se demostró que el complejo I se convierte en complejo II en presencia de exceso de ion Sn(II) y ese complejo II (^99mTc(III)-DMSA) se localiza principalmente en el riñón. Los complejos III y IV se forman por titulación de complejos I y II, respectivamente, a un pH alcalino. El complejo III es similar al complejo I, localizado principalmente en hueso, y los complejos II y IV se localizan en riñones ⁽⁶¹⁾. Los complejos I y II deben estar presentes principalmente en el kit radiofarmacéutico de Sn-DMSA debido al pH bajo ⁽⁶⁵⁾. El máximo rendimiento del complejo II se encontró que es dependiente del pH, la concentración de oxígeno de la mezcla de reacción y el tiempo de incubación. La localización en riñón de los complejos preparados a un pH no se altera apreciablemente si el pH se cambia más tarde ⁽⁶⁾.

La reacción de marcaje de ^99mTc-DMSA procede en dos pasos: la formación rápida de complejo I, seguida por una etapa más lenta de conversión hacia el complejo II. Ésta es la razón de la necesidad de un período de incubación de 10 minutos. El complejo II puede verse afectado por la presencia de oxígeno que actúa en la oxidación previa del par reductor Sn(II) /Sn(IV), lo que disminuye el potencial de reducción del sistema, y puede revertir una vez formado el complejo II al complejo I. Para disminuir la pérdida del poder reductor del sistema la preparación del complejo debe realizarse en atmósfera de N₂ o Ar.

La captación disminuida del riñón ocurre porque el complejo I se excreta rápidamente del sistema. Además de la captación disminuida de riñón, se ha descrito que aumenta la actividad en hígado cuando una solución de ^99mTc-DMSA se inyecta 20 minutos después de la adición de 1 mL de aire al vial de reacción. La inclusión de ácido ascórbico en los kits retarda esta oxidación ⁽⁶⁰⁾. El kit liofilizado puede marcarse actualmente en el mercado con 3mL de pertecnectato, es estable por 4 horas siguientes a la preparación, y el pH final debe encontrarse entre 2 y 3 (Tabla 3) ^(51,60).

El estudio analítico indica que los complejos de ^99mTc-DMSA no contienen Sn, como un complejo mixto de metal del tipo Tc-Sn-DMSA. El análisis estructural preliminar por RMN sugiere que la estructura química del complejo que se localiza en riñón está constituido por un dímero que consta de un átomo de ^99mTc rodeado por dos moléculas de DMSA ⁽⁶¹⁾.