Material y Método
Todos los reactivos y disolventes utilizados fueron de pureza analítica adecuada, los solventes orgánicos fueron de grado HPLC. Las soluciones acuosas se prepararon con agua destilada, se filtraron a través de membranas Millipore 0,22 μm y se desgasificaron en baño de ultrasonido.
El 99mTcNaTcO4 se eluyó de un generador comercial (Tecnonuclear, Argentina).Los complejos tricarbonílicos se obtuvieron mediante una ruta de síntesis en dos etapas. La primera etapa consistió en la preparación del precursor, fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ de acuerdo con lo descrito por Alberto et al.17-18, brevemente borohidruro de sodio (7,0 mg), tartrato de sodio y potasio (20 mg) y carbonato de sodio (4,0 mg) bajo atmósfera de CO(g) con posterior agregado de 99mTcO4Na (740 MBq, 20mCi) e incubación a 60-70 ºC durante 30 min. Su pureza radioquímica fue controlada mediante HPLC de fase reversa con una columna Phenomenex C18-LUNA (5µm, 150 x 4,60 mm), flujo 1,0 mL/min y como fase móvil metanol y una solución de H3PO4(aq) llevada a pH 2,5 con trietilamina; los gradientes se muestran en la tabla 1.
Después del calentamiento, el complejo se neutralizó con buffer fosfato (NaH2PO4) 390 mg/mL en relación de volumen 10:1 carbonilo:fosfato. El pH final de la solución se mantuvo entre 6,5 y 7,5 después de la neutralización. La sustitución de los ligandos de interés (L), Fluconazol (F) o Voriconazol (V) se logró mediante la adición de una alícuota de 200 a 400 mL del precursor neutralizado a 5 mg del ligando (L) previamente disuelto en 200 μL de etanol anhidro absoluto y se llevó a un volumen final de 1 mL con agua para inyección. La mezcla se incubó en baño de agua a 65-67 °C durante 30 minutos. La pureza radioquímica fue controlada por HPLC utilizando el mismo sistema mencionado anteriormente.
| Tiempo (min) | % solución H3PO4 | % MeOH |
|---|---|---|
| 0-3 | 100 | 0 |
| 3-6 | 100-75 | 0-25 |
| 6-9 | 75-66 | 25-34 |
| 9-20 | 66-0 | 34-100 |
| 20-27 | 0 | 100 |
| 27-30 | 0-100 | 100-0 |
Evaluación in vitro
Para analizar la estabilidad temporal, se evaluó por HPLC a distintos tiempos la pureza radioquímica in vitro de los complejos mantenidos en el medio de reacción.
La unión a proteínas se estudió mediante incubación de 25 µL del complejo con 475 μL de plasma humano a 37 °C. Se extrajo una alícuota de 50 µL de la mezcla a 30, 60, 90 min post-incubación y se sembró en una micro columna de gel filtración (MicroSpin G-50 GE). La columna se centrifugó a 2000 rpm durante 2 minutos; se determinó la actividad eluída y retenida en la columna en un contador de centelleo sólido EGyG ORTEC. El porcentaje de unión a proteínas (UPP) se determinó por medio del porcentaje de actividad eluída. El procedimiento se realizó por triplicado y contra un blanco con NaCl 0,9%.
La lipofilia se determinó a través del coeficiente de partición de los complejos entre n-octanol y buffer fosfato de sodio (0,1 M; pH 7,4). En un tubo de centrífuga se colocaron 2,0 mL de n-octanol, 1,8 mL de buffer fosfato y 0,2 mL del complejo. La mezcla se agitó en un Vortex durante 2 min y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se midieron muestras de 0,2 mL de cada fase (n = 3). La lipofilia se expresa como: L= log P, donde P = (act. octanol)/(act. buffer).
La estabilidad en plasma se investigó incubando un volumen de 50 µL de los complejos con 950 µL de plasma humano en baño de agua a 37 °C. Se recogieron alícuotas de 200 µL a tiempos de 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas, a las que se indujo la precipitación de las proteínas con 200 µL de EtOH anhidro frío (-15 °C) y agitación en Vortex; posteriormente se incubaron 5 minutos en freezer. Se separó el pellet del sobrenadante mediante centrifugación a 15.000 rpm por 5 min. Se analizó una muestra de sobrenadante por HPLC según el sistema de referencia (tabla 1).
Para el ensayo de unión de levaduras se prepararon las siguientes soluciones de acuerdo a Welling et al4: Solución A: Buffer fosfato 14 mM, pH 7,5. Suspensión B: C. albicans 15x108 cfu/mL en solución A (Cat. Nº 0443, Lote 443-183 ATCC (R) 10231TM). Solución C: 0,01% de Tween 80 en Buffer A. Solución D: ácido acético 0,1%. Solución E: mezcla v/v de soluciones C y D, preparada inmediatamente antes de su uso. Se prepararon 7 diluciones en serie de la suspensión B (n=2) con solución de NaCl 0,9% en tubos Ependorff y un tubo de control conteniendo solamente NaCl 0,9% (volumen final = 0,4 mL/tubo). Cada tubo recibió 0,8 mL de solución de E y se incubó 15 min a 4 °C para estabilizar los microorganismos. Luego se añadió a cada tubo 0,1 mL de la molécula marcada previamente diluido 1/10 en buffer A y se incubaron durante 1 h a 4 °C. Se midió la actividad de la serie completa y se centrifugó a 2500 rpm durante 5 min a 4 °C. Se descartó el sobrenadante, el sedimento se resuspendió con 1 mL de solución E y se centrifugó nuevamente a 2500 rpm por 5 min a 4 °C. El sobrenadante fue descartado cuidadosamente para evitar perturbar el sedimento y se midió su actividad final. El porcentaje de unión se calculó como: (actneta pellet*100%)/(actnetaTotal).
Evaluación in vivo
Todos los procedimientos de biodistribución en animales se realizaron de acuerdo al protocolo aprobado por la Comisión Honoraria de Experimentación Animal (CHEA, Universidad de la República, Uruguay). El modelo animal consistió en ratones hembras CD1 de 8-10 semanas de edad y un peso entre 22±2 g (n=3 por grupo). Los animales fueron mantenidos en condiciones de alojamiento higiénicas, con ciclos de 12:12 horas de luz-oscuridad y temperatura de 22±2 °C, con alimento y agua ad libitum. La evaluación biológica se realizó en cuatro grupos, uno con animales normales para determinar la distribución biológica del complejo, con especial atención en sangre, comportamiento farmacocinético, vías de eliminación y sitios de captación como referencia. Un segundo grupo de animales a los que se indujo inflamación estéril por inyección de 0,2 mL de aceite de Trementina diluida en suero fisiológico (1:5 v/v) en la pata trasera izquierda. A los grupos tercero y cuarto se indujo la infección con 0,2 mL (9x108ufc) de C. albicans (Nº catálogo 0443 Lote 443-183 ATCC (R) 10231TM) y A. niger (Nº catálogo 0392 Lote 392-87 ATCC (R) 16404TM) respectivamente, en la pata trasera izquierda. Los complejos diluidos en suero fisiológico se administraron por vía IV en la vena de la cola (37 MBq, 1mCi en 0,1 mL). A tiempos de biodistribución de 1 y 3 horas, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y los órganos extraídos en forma individual a fin de medir la actividad acumulada en cada uno de ellos. Se colectaron muestras de orina, sangre, músculo, hueso y del sitio de infección/inflamación.
Previamente, para la adquisición de imágenes, los animales fueron anestesiados con isofluorano 2,5% en flujo de 1,5 mL/min de O2. La adquisición se realizó a un tiempo de 3 h post inyección, en un sistema de imagen preclínico para pequeños animales TriumphTM PET / SPECT / CT (Gamma Medica, Inc.) durante 60 min, ROR de 40 mm, colimador 5-pinhole, matriz de 80x80 píxeles.
