Resultados y discusión

Elaboración y caracterización nanotecnológica y radioquímica del agente multimodal 

La elaboración del agente multimodal se realizó a partir de 4 preparaciones preliminares, de acuerdo con la combinación de los componentes descriptos en la Tabla 2, que difieren en el aporte de ICG para cada una de las opciones, la cual se agrega a cada una de las preparaciones a partir de una dilución de la solución madre. La dilución de la ICG es necesaria debido al efecto de “quenching” que puede surgir a altas concentraciones del agente fluorescente y que interferirá con la detección de la señal (fig. 3). Este efecto debe tenerse en cuenta para seleccionar la dilución de ICG que no produzca “quenching” in vivo, pero que conserve suficiente intensidad de señal en relación al fondo cuando la preparación es fraccionada para ser administrada a los animales de experimentación. Los resultados de estas pruebas mostraron que en las diluciones 1/10 y 1/100 se produce “quenching” in vitro. Sin embargo, teniendo en cuenta que las mismas serán utilizadas en la preparación del agente resultando en dilución 1/3 y que posteriormente se administrará 0,1 mL como volumen máximo en el miembro a evaluar en las ratas (dilución in vivo), igualmente fueron las diluciones seleccionadas para los ensayos de caracterización in vitro e in vivo.

La caracterización radioquímica del agente multimodal mostró la co-localización de la señal fluorescente debido a la ICG y de la señal radiactiva debido al ^99mTc, presentes en su composición, cuando se realizó el revelado de los sistemas cromátográficos para evidenciar posibles impurezas resultantes de su elaboración. Adicionalmente, se comprobó que el agente multimodal pudo separarse de las impurezas radioquímicas resultantes de las marcaciones con ^99mTc en general (el ^99mTcO₄^-) y de aquellas que utilizan cloruro estañoso como agente reductor, como en este caso particular (el ^99mTc-hidrolizado o coloidal). La eficiencia de marcación del agente multimodal resultó superior al 90% en todos los ensayos realizados; este resultado es compatible con las especificaciones de calidad que en general cumplen los agentes para imágenes radioisotópicas. La figura 4 muestra un esquema representativo del ensayo descripto; ambas diluciones de ICG seleccionadas anteriormente (1/10 y 1/100) alcanzaron resultados satisfactorios y por tanto fueron empleadas en los estudios in vivo. 

La caracterización nanotecnológica del agente multimodal se realizó analizando el tamaño y forma de las partículas coloidales mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y por dispersión dinámica de la luz (DLS). En primer lugar, se obtuvieron datos acerca del nanocoloide original (^99mTc-GCB) ya que su preparación se realizó en condiciones diferentes a las sugeridas por el fabricante. En este sentido, se analizó la distribución del tamaño de partícula a 25°C simulando la temperatura ambiente de preparación y a 37°C simulando la temperatura corporal de los animales de experimentación. Por otra parte, debido a que el juego de reactivos así utilizado posee tres fracciones similares remanentes luego de la reconstitución, se estudió la distribución del tamaño de partícula de dichas fracciones luego de su congelamiento por 7 días y posterior descongelamiento para la preparación del agente. Esta práctica se denomina “kit splitting” y permite un mayor aprovechamiento del juego de reactivos, en tanto se validen sus características de calidad en la situación de empleo⁽¹⁵⁾.

En el caso del ^99mTc-GCB, se observaron diferentes poblaciones de tamaño; el 52% de las partículas presentaron tamaños < 100 nm, el 43% entre 100-450 nm y solo el 5% > 450 nm (fig. 5). Estos valores se mantienen relativamente constantes hasta 6 hs luego de la elaboración, indicando que no existe agregación del coloide y que el sistema es estable con estas condiciones de preparación y a temperatura ambiente. Estos resultados avalan el uso del producto reconstituido de esta forma ya que, aunque no responde a lo especificado en las instrucciones del proveedor, la distribución de tamaños se corresponde con la habitual para radiofármacos empleados en biopsia de GC. Según la bibliografía, partículas < 4-5 nm penetran en capilares y no migran a linfáticos; las partículas entre 10-100 nm son las que desaparecen rápidamente del espacio intersticial y se acumulan en ganglios linfáticos; y las partículas > 500 nm presentan muy baja velocidad de migración, permaneciendo más tiempo alrededor del punto de inyección y más tarde son retenidas en el primer ganglio del circuito. Dado que el ensayo realizado a 37°C (fig. 5) simulando la temperatura corporal no muestra variaciones significativas en el tamaño de partícula ni en su distribución, su comportamiento in vivo sería predecible según este parámetro. 

Cabe destacar que el “kit splitting” realizado con el juego de reactivos para preparar el nanocoloide no afectó el tamaño de partícula así como tampoco su distribución a temperatura ambiente o en simulación de temperatura corporal, cuando las fracciones remanentes permanecieron congeladas a -20°C durante 7 días y bajo estas condiciones de elaboración. En el caso de la fracción descongelada y evaluada a 25°C, el 52% de las partículas midió < 100 nm, el 6% (±1) > 450 nm y solo el 41% (±1) se encontraba entre 100-450 nm. Para el caso de la fracción evaluada a 37°C, el 53% de las partículas fue < 100 nm, el 44% entre 100-450 nm y solo el 3% > 450 nm. 

En base a estos datos, se procedió a caracterizar la distribución de tamaño de un preparado fresco del agente multimodal elaborado con ^99mTc-GCB y con ICG.  Los resultados mostraron que a 25ºC se observa una población heterogénea en tamaño de partícula, con una distribución estable dentro de las primeras 2 hs de preparación. A partir de la tercera hora se observan fenómenos de agregación, resultando en un incremento de las poblaciones con tamaño de partícula > 450 nm y una disminución marcada de las partículas < 100 nm. Sin embargo, no se observan variaciones en el porcentaje de partículas en el rango de 100-450 nm durante las primeras 4 hs de preparado el producto. En el caso en que la preparación se realiza a partir de una fracción descongelada proveniente del “kit splitting”, estos resultados muestran ciertas variantes, con la repetición de fenómenos de agregación de partículas pequeñas para incrementar la presencia de partículas > 450 nm y, para el caso de aquellas comprendidas entre 100-450 nm, presencia estable hasta 2 hs luego de preparado. 

En conjunto, estos resultados permiten determinar que el agente multimodal posee características nano-radiofarmacéuticas similares al radiofármaco coloidal de referencia y puede ser utilizado dentro de las 4 hs luego de preparado a partir de un juego de reactivos fresco, o hasta 2 hs a partir de una fracción congelada, conservando su distribución de tamaño de partícula compatible con la sugerida para biopsias de GC.

Determinación del comportamiento biológico del agente multimodal para la identificación de ganglios linfáticos

Como punto de partida se determinó el perfil de migración del radiofármaco coloidal para obtener los tiempos de trabajo de referencia para la adquisición de imágenes radioisotópicas pre-quirúrgicas y la posterior extracción de ganglios linfáticos mediante la obtención de imágenes fluorescentes intra-quirúrgicas. La figura 6 muestra en la linfocentellografía el ascenso simétrico del radiocoloide en forma secuencial desde el sitio de administración y en dirección ascendente por los vasos linfáticos de los miembros inferiores. Alrededor de los 30 minutos el ascenso se ha completado y la captación permanece en los mismos sitios de visualización hasta las 24 horas luego de la administración.  El análisis cuantitativo del perfil de migración del ^99mTc-GCB, considerando las regiones de interés sobre los principales ganglios linfáticos de la rata y las respectivas curvas de actividad/tiempo, resultó concordante con el análisis cualitativo. 

La puesta a punto en la concentración de ICG, así como del volumen final de agente multimodal a administrar, se llevó adelante en el modelo animal por evaluación de la calidad de las imágenes de los ganglios linfáticos a tiempos tardíos con cada modalidad de detección. De esta forma, se evaluó la situación más diferida entre la administración y la cirugía en cuanto a la conservación de detección. Así, la combinatoria de la información de las imágenes preoperatorias y las intraoperatorias mostró que la dilución 1/10 de ICG brinda una señal adecuada para la detección en quirófano de los GL y que los volúmenes finales de 0,1 o 0,05 mL son adecuados para la administración (fig. 7). Por lo tanto, el volumen definitivo de la administración podría ajustarse de acuerdo con el peso del animal en los siguientes ensayos, el cual en nuestro caso fue fijado en 0,05 mL.

Finalmente, luego de poner a punto todas las variables intervinientes en el protocolo, se realizó la identificación de los GL utilizando el agente multimodal, simulando dos situaciones quirúrgicas: a tiempos tempranos y tardíos (fig. 8).

Las imágenes intra-operatorias obtenidas por visualización directa del tejido en el monitor que captura la imagen de fluorescencia en la cámara de uso quirúrgico, permiten la rápida localización de los ganglios correspondientes al drenaje de la almohadilla plantar de la rata. Esto se logra debido a la plena coincidencia del posicionamiento identificado en las imágenes pre-operatorias con la observación de la señal fluorescente una vez que los tejidos fueron expuestos quirúrgicamente. Cabe destacar que la localización de los GL fue posible aún en presencia de la luz provista por los artefactos luminosos del quirófano, sin interferencia.