Materiales y métodos

Elaboración del agente multimodal para imágenes

Se diluyeron 25 mg de ICG en 10 mL de solución fisiológica (2,5mg/mL); a partir de la misma, se prepararon diluciones 1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10000. Por otra parte, se diluyó un frasco conteniendo 7,5 mg de gelatina de colágeno bovino (GCB; Linfofast, Laboratorios Bacon SAIC, Argentina) en 4 mL de solución fisiológica (1,88 mg/mL). En frascos independientes, se colocó 1 mL de cada dilución de ICG y 1 mL del coloide de GCB. Finalmente, a cada frasco se agregó 814 MBq (22,2 mCi) de ^99mTcO₄^- en un volumen de 1 mL, eluído a partir de un generador ⁹⁹Mo-^99mTc (Laboratorios Bacon SAIC, Argentina); el volumen final de cada vial resultó de 3 mL. La Tabla 2 muestra el resumen de las preparaciones multimodales preliminares obtenidas según la proporción de la dilución de ICG y el coloide preformado para conformar el agente híbrido. 

Composición de las preparaciones multimodales preliminares
Frasco	Dilución ICG	ICG alícuota	99mTcO4-alicuota/actividad	GCB alícuota	Volumen final	Concentración final ICG/actividad
1	1/10	1mL	1mL / 814 MBq	1mL	3mL	83,33 ug/mL / 271 MBq/mL
2	1/100	1mL	1mL / 814 MBq	1mL	3mL	8,33 ug/mL / 271 MBq/mL
3	1/1000	1mL	1mL / 814 MBq	1mL	3mL	0,83 ug/mL / 271 MBq/mL
4	1/10000	1mL	1mL / 814 MBq	1mL	3mL	0,083 ug/mL / 271 MBq/mL

Caracterización nanotecnológica y radioquímica del agente multimodal

La caracterización del tamaño de partícula del agente multimodal, su distribución y su morfología se realizó mediante mediciones del diámetro hidrodinámico promedio y su distribución, empleando el método de dispersión dinámica de la luz (DLS; Zetaziser Nano-ZSP, ZEN5600, ángulo de dispersión θ = 173°, Malvern Instruments, UK) y microscopía electrónica de trasmisión (TEM; Philips CM-12 TEM apparatus, FEI Company, The Netherlands). Las muestras (1 mL) se analizaron por triplicado y fueron equilibradas a la temperatura de análisis (25°C y 37°C) durante 5 minutos antes de cada determinación. Estos ensayos se realizaron de forma comparativa con aquellos en los que se caracterizó el ^99mTc-radiocoloide empleado en las formulaciones. Asimismo, se ensayaron los mismos parámetros descriptos anteriormente para preparaciones realizadas a partir de fracciones conservadas por congelamiento de los precursores no radiactivos de la formulación. Para los ensayos en DLS, las muestras (1 mL) fueron medidas de forma directa sin preparación, mientras que para la medición en TEM se realizó la tinción con una solución de ácido fosfotúngstico al 1% p/v.

La eficiencia de la marcación con ^99mTc fue determinada mediante cromatografía ascendente utilizando ITLC (Varian, USA) como fase estacionaria y metil-etil-cetona como fase móvil. En este sistema, el Rf del ^99mTcO₄^- libre es de alrededor de 0,9-1,0 mientras que para las impurezas radiocoloidales el Rf = 0. Se espera que el agente multimodal de naturaleza nanoparticulada presente también Rf = 0, por similitud en su estructura radioquímica con el radiocoloide original. Por otro lado, para comprobar que la preparación resulta en un agente multimodal verdadero y diferenciarla de las impurezas radiocoloidales, se realizó una cromatografía ascendente utilizando ITLC como fase estacionaria y una mezcla de piridina:ácido acético:agua (3:5:1,5) como fase móvil⁽¹⁴⁾. Este sistema permite la separación de las impurezas radiocoloidales, ya que presentan Rf = 0, mientras que los sistemas nanoparticulados migran con RF = 0,5-1,0. 

Estudios in vivo en animales de experimentación

Se utilizaron ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley (peso corporal 195±12 g; Bioterio Central, Fac. de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires) que fueron alojadas en jaulas de acero inoxidable en la sala de animales, acondicionada a temperatura de 22-23°C con humedad cercana al 56% y con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de los Animales de Laboratorio (CICUAL; Res (D) N°671/18) de la Fac. de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires.

Administración de las preparaciones

La administración de las distintas preparaciones del agente multimodal o del ^99mTc-GCB utilizado con fines comparativos, se realizó mediante la inyección de habones subdérmicos en los miembros inferiores de las ratas, bajo anestesia con isofluorano 2% utilizando oxígeno como vehículo, de modo de lograr su inmovilización durante todo el procedimiento, incluyendo la adquisición de imágenes.

Selección del volumen de administración y dilución del agente multimodal

Para el ensayo de selección de la preparación del agente multimodal y ajuste del volumen de inyección, se comenzó por la administración de las formulaciones más concentradas descriptas en la Tabla 2, de manera de evaluar el efecto del “quenching” in vivo. Las formulaciones se administraron de acuerdo con el siguiente esquema: pata derecha 0,1 mL del agente multimodal (para la dilución 1/10 corresponde a 8,33 µg ICG y para la dilución 1/100 corresponde a 0,83 µg ICG, conteniendo 81,4 MBq en ambos casos) y pata izquierda 0,05 mL del agente híbrido (para la dilución 1/10 corresponde a 4,16 µg ICG y para la dilución 1/100 corresponde a 0,41 µg ICG, conteniendo 40,7 MBq en ambos casos). En base a los resultados y una vez seleccionada la preparación multimodal definitiva, las administraciones se realizaron según el mismo procedimiento descripto en el item anterior.

Caracterización del comportamiento biológico del ^99mTc-GCB y del agente multimodal

Luego de la administración del ^99mTc-GCB o del agente multimodal, según el protocolo correspondiente, los animales fueron posicionados en una cámara gamma (Ohio Nuclear, Alfanuclear) de campo chico equipada con colimador de alta resolución para la adquisición de imágenes centellográficas pre-operatorias, continuando bajo el efecto de la anestesia. Estas imágenes fueron adquiridas según protocolo dinámico inmediatamente luego de la administración hasta los 30 min; posteriormente se obtuvieron imágenes estáticas a diferentes tiempos y hasta las 24 hs, según se evaluara la distribución del ^99mTc-GCB o del agente multimodal. Las imágenes fueron procesadas utilizando software dedicado para animales de laboratorio (IM512, Alfanuclear, Argentina) a fin de realizar semicuantificaciones a partir de la selección de áreas de interés y construcción de curvas de actividad en función del tiempo. 

Para validar la caracterización del comportamiento biológico del agente multimodal según lo observado en las imágenes radioisotópicas, los animales fueron trasladados al quirófano donde se practicó su eutanasia y la posterior identificación intra-operatoria de GL mediante una cámara portátil de fluorescencia (Laboratorios Bacon SAIC, Argentina) empleando luz de excitación de 745 nm y filtros detectores de 820 nm (fig. 2). El detector portátil se encuentra acoplado a un ordenador equipado con software para la reproducción y captura de imágenes estáticas y en modo cine. La validación intra-operatoria de la distribución biológica del agente multimodal fue realizada a 1 h y 24 hs post-administración.

Estudio histopatológico

Los GL extraídos en los procedimientos quirúrgicos fueron procesados para análisis histopatológico de confirmación de tejido ganglionar por inclusión en parafina, corte y posterior tinción con hematoxilina-eosina. El análisis de los preparados se realizó mediante microscopio óptico (Axiolab Carl Zeiss, Göttingen, Germany) acoplado a una cámara fotográfica (Canon PowerShot G5, Japón), que permitió la documentación de los resultados.