Artículo original 01 de febrero de 2012

Desarrollo y evaluación de un ligando flexible para la preparación de radiofármacos de 99mTc

Nancy Crócamo, Javier Giglio, Soledad Fernández, Ana María Rey Ríos.

Resumen

Nuestro objetivo fue desarrollar dos métodos de marcación con 99mTc (mediante complejos 99mTc(III)-4+1 y 99mTc(I)-tricarbonilos) con un ligando flexible conteniendo el grupo 5-nitroimidazol como farmacóforo biorreducible y el grupo isonitrilo para coordinar el metal. Los complejos fueron comparados a través de su estabilidad, lipofilicidad y unión a proteínas plasmáticas. Ambos complejos fueron obtenidos con adecuada pureza radioquímica (PR) y resultaron estables al menos 4h post-marcado, al menos 2h post-incubación en plasma humano y frente a L-cys. El complejo 99mTc(III)4+1 presentó una lipofilicidad (log.P) de 0,083 y una unión a proteínas plasmáticas tras 1 hora de incubación de 30% aproximadamente. El complejo 99mTc(I)-tricarbonílico mostró una menor lipofilicidad (0,065) y unión a proteínas plasmáticas de aproximadamente 10%.

De acuerdo a los resultados se espera que el complejo 99mTc(I)-tricarbonílico presente rápida depuración sanguínea y excreción preferentemente renal, propiedades deseables para un radiofármaco.

Introducción

El desarrollo de radiofármacos de 99mTc de tercera generación depende de la posibilidad de contar con métodos de marcación que preserven la actividad biológica del ligando original. Asimismo, es sabido que la metodología de marcación utilizada para combinar el Tc con el ligando de interés tiene gran influencia sobre el comportamiento fisicoquímico y biológico del compuesto resultante(1,2). Existen diversas opciones interesantes en este sentido, en particular complejos tricarbonílicos de Tc(I) [Tc (CO)3L], y complejos Tc(III) de tipo 4+1, entre otras. Para la formación de cada uno de estos tipos de compuestos se requieren combinaciones de grupos donores de electrones específicas(3-6). Sin embargo, existen algunos grupos funcionales que pueden ser empleados en la obtención de los dos tipos de compuestos antes mencionados, permitiendo de esta manera modular las propiedades del compuesto final.

Tomando en cuenta lo anteriormente expuesto, el presente trabajo tuvo por objetivo desarrollar diversas metodologías de marcación con 99mTc de un mismo ligando biológicamente activo y la comparación de las propiedades fisicoquímicas relevantes del radiotrazador en relación con su potencial aplicación como radiofármaco para diagnóstico oncológico. El ligando seleccionado fue el 4-isociano-N-[2-(2-metil-5-nitro-1H-imidazol-1-il) etilbutanamida (METCN), que se representa en la figura 1.

Figura 1
Figura 1 Estructura del ligando utilizado en este estudio.

Se trata de un derivado del metronidazol, fármaco antiparasitario que contiene el grupo 5-nitroimidazol como farmacóforo biorreducible y el grupo isonitrilo para coordinar el metal. Los 5-nitroimidazoles son compuestos biorreducibles que son irreversiblemente reducidos en células con baja presión de O2 por acción de enzimas intracelulares, originando compuestos hidrofílicos que quedan atrapados dentro de la célula(7). Por este motivo se ha propuesto su utilización en la preparación de potenciales radiofármacos para detección de zonas hipóxicas en tumores, ya que este estado es un factor fundamental para la falla de los tratamientos de radioterapia externa y también en la quimioterapia.

El ligando seleccionado actuará como monodentado frente al Tc, ya que posee un grupo isonitrilo (NC) como donador de electrones, pudiendo unirse al metal en distintas formas actuando en combinación con coligandos adecuados. En la Figura 2 se muestran dos posibles formas de unión del ligando en estudio al Tc.

Figura 2
Figura 2 Estructura propuesta para los 2 complejos de 99mTc estudiados.

Los complejos tricarbonílicos de Tc(I) son compuestos en los cuales tres de las posiciones de coordinación del metal son ocupadas por grupos CO fuertemente unidos y las otras tres posiciones pueden ser ocupadas por un ligando tridentado o por la acción simultánea de un ligando monodentado y un coligando bidentado (complejos de tipo 2+1)(6). Para la marcación del ligando METCN mediante la formación de complejos tricarbonílicos de tipo 2+1 se utilizó la acetilacetona como coligando bidentado.

Otra opción para la marcación del ligando de interés es la formación de complejos mixtos 4+1 de Tc(III)(3,4), los que se forman por combinación del ligando tetradentado de tipo NS3 , 2,2’,2” nitrilotris-etanotiol junto con el isonitrilo METCN en estudio. Fueron preparados ambos complejos y sus propiedades fisicoquímicas (estabilidad en medio de reacción, en plasma humano y frente a cisteína, lipofilicidad y unión a proteínas plasmáticas) fueron comparadas a fin de establecer la influencia del método de marcación en las propiedades del potencial radiofármaco.

Materiales y métodos

Marcación con 99mTc

La marcación mediante la formación de complejos 99mTc(III) “4+1” fue realizada en dos pasos utilizando 99mTc-EDTA/Manitol como complejo precursor. Éste fue obtenido por agregado de 99mTcO4- (20 mCi) y SnCl2 (6,0 mg en 50 µL de HCl concentrado y 6,0 mL de H2O) a una solución acuosa de EDTA (5,0 mg) y manitol (5,0 mg), ambos en 200 µL de H2O e incubando 10 min a temperatura ambiente. La pureza radioquímica (PR) fue controlada mediante cromatografía en papel Whatman nº1/acetona. La formación del complejo final 99mTc(METNC)NS3 se logra mezclando 200 µL del precursor con 100 µL de una solución de coligando 2,2’,2’’-nitrilotris etanotiol (NS3) (0,6 mg en 200 µL de H2O) y 1,0 mL de una solución de ligando METCN (0,2 mg en 2,0 mL de acetonitrilo) e incubando a 60 ºC durante 1 h. La (PR) fue determinada mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gama NaI(Tl) utilizando una columna Waters C18 (Bondapack™ 125 Å, 10 µm, 3,9 x 300 mm), y un gradiente de fase móvil: (A) ácido tifluoroacético 0,1% en agua y (B) ácido trifluoroacético 0,1% en acetonitrilo a un flujo de 1,0 mL/min, el gradiente de solventes se muestra en la tabla 1.

Tiempo (min) Ac. Trifluoroacético en CH3CN (%)
0-3 0
3-10 0-100
10-20 100
Tabla 1. Gradiente de solventes utilizado para el control de PR para los complejos de 99mTc(III) “4+1”.

El complejo 99mTc(I)–tricarbonílico “2+1” se preparó a partir del precursor fac[99mTc(CO)3(H2O)3]+, obtenido a partir de borohidruro de sodio (7,0 mg), tartrato de sodio y potasio (20 mg) y carbonato de sodio (4,0 mg) bajo atmósfera de CO(g) con posterior agregado de 99mTcO4Na (20 mCi) e incubación a 65-70 ºC durante 30 min. Su PR fue controlada mediante HPLC de fase reversa con una columna Phenomenex C18-LUNA (5µm, 150x4,60mm), flujo 1,0 mL/min y como fase móvil metanol y una solución de H3PO4(aq) llevada a pH=2,5 con trietilamina. El gradiente de solventes utilizado se encuentra en la tabla 2.

Tiempo (min) % solución H3PO4 % MeOH
0-3 100 0
3-6 100-75 0-25
6-9 75-66 25-34
9-20 66-0 34-100
20-27 0 100
27-30 0-100 100-0
Tabla 2. Gradiente de solventes utilizado para el control de PR para el precursor fac[99mTc(CO)3(H2O)3]+.

Posteriormente se realizó una primer sustitución con el coligando 2,4-Pentanodiona (acetilacetona). Para ello se mezclan 250 µL de precursor previamente neutralizado con 100 µL de NaH2PO4 (390 mg/mL) y se agregan 300 µL de una solución acuosa 0,1M del coligando, incubando a 80 ºC durante 30 min. Su PR fue controlada en las mismas condiciones que el precursor correspondiente. El último paso consistió en mezclar 150 µL de este complejo intermediario y adicionar 3,0 mg del ligando METCN y calentar 30 min a 80 ºC. La PR del complejo final fue controlada con las condiciones anteriormente mencionadas.

Lipofilicidad y unión a proteínas plasmáticas

Para cada complejo obtenido por la lipofilicidad fue estudiada a pH 7,4 a través de la determinación del correspondiente coeficiente de repartición octanol/buffer. Para ello, fueron mezclados 2,0 mL de octanol en un tubo de centrífuga con 2,0 mL de buffer fosfato 0,1M, pH=7,4. Se agregaron posteriormente 100 µL del complejo a estudiar, agitándose mediante vórtex durante 2 min. La mezcla fue centrifugada por 5 min a una velocidad de 5000 rpm y, una vez separadas ambas fases, se midió la actividad en alícuotas de cada una de ellas en un contador de centelleo sólido de NaI(Tl) de 3”x 3”.

La unión a proteínas plasmáticas fue determinada por el método de exclusión molecular, luego de 60 min de incubación de 50 µL de cada complejo marcado con 950µL de plasma humano a 37ºC. Para ello, fueron sembradas muestras de plasma (50 µL) sobre columnas Microespin conteniendo Sepahdex® G-50. La elución se realizó centrifugando las columnas a 3300 rpm durante 2 min. La actividad retenida en la columna y la actividad eluída fueron medidas en un contador de centelleo sólido de NaI(Tl) de “3x 3”.

Estabilidad en el tiempo, en plasma humano y en L-cys

La estabilidad en el tiempo de los complejos de interés se analizó tomando muestras de cada uno de ellos y controlando su PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gamma en las condiciones de solventes nombradas con anterioridad, a los 30 min y a 1, 2, 3 y 4 h post-marcado.

La estabilidad en plasma humano fue estudiada realizando la incubación a 37ºC de 100 µL del complejo de interés con 900 µL de plasma humano, retirando muestras a los 30 min, 1 y 2 h post-incubación. A cada muestra se le adicionan 100 µL de etanol absoluto a -15.0ºC y esta mezcla se mantuvo en frío durante 5 min. Una vez transcurrido el tiempo, se centrifugó a 15000 rpm durante 5 min a 0ºC. Finalmente se tomaron muestras del sobrenadante generado y se realizó el control de PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gama en las condiciones de solventes adecuadas para cada marcado.

La estabilidad en L-cys se estudió mediante la incubación de 100 µL de cada complejo con 0,4 mg de L-cys a 37ºC. Se realizan tomas de la mezcla a los 30 min, 1 y 2 de incubación analizando su PR mediante HPLC de fase reversa acoplado a un detector gamma en las condiciones de solventes adecuadas para cada marcado.

Resultados

Marcación con 99mTc

Ambas técnicas de marcación utilizadas fueron realizadas por sustitución, utilizando en cada caso un precursor adecuado y realizando luego la sustitución mediante el ligando de interés y un coligando adecuado. La preparación del precursor 99mTc(III)EDTA/ manitol se realizó mediante la reducción del pertecneciato de sodio en una solución acuosa de EDTA y manitol. Su PR fue superior al 90%, condición necesaria para seguir con la posterior sustitución. El siguiente paso consistió en la sustitución del precursor por el ligando de interés y un coligando, un ligando tetradentado de tipo NS3 que completa la esfera de coordinación del metal. La PR del complejo final resultó de 60-65% con un tiempo de retención (tr.) de 9,98 min. Por tal motivo fue necesario realizar una purificación mediante HPLC previo a su caracterización fisicoquímica. Se encontró que el complejo de interés es estable al menos 4 h post-marcado, 2 h post-incubación en plasma humano y frente a un exceso de L-cys.

La preparación del complejo 99mTc-tricarbonílico de Tc(I) implicó la formación del precursor fac[99mTc(CO)3(H2O)3]+ obtenido por reducción del pertecneciato en atmósfera de CO(g) a presión atmosférica. Su PR fue superior al 90%, con un tr de 3,4 min. La formación del complejo tricarbonílico final fue realizada en 2 etapas: sustitución de 2 moléculas de agua del precursor mediante el coligando bidentado acetilacetona y posterior sustitución de la tercer molécula de agua por el ligando de interés. La PR de intermediario y complejo final fue superior al 90% y los tr de 18,7 y 17 min respectivamente. El complejo final de interés fue estable al menos 4 h post-marcado y mantuvo su PR incambiada al menos 2 h post-incubación en plasma humano y frente a un exceso de L-cys.

Lipofilicidad y unión a proteínas plasmáticas

La lipofilicidad fue estudiada a través del coeficiente de partición entre octanol/buffer fosfato 0.1M, pH=7.4. Para el complejo 99mTc(METNC)NS3 se obtuvo un valor de logP=0.083 y para el complejo 99mTc(I) (CO)3(METNC)-acetilacetona fue de logP=0.065. La unión a proteínas plasmáticas medida tras 1 h de incubación resultó para 99mTc(METNC)NS3 de aproximadamente 30% y para 99mTc(METNC)acetilacetona, de 10%.

Discusión

El tecnecio, debido a su rica química de coordinación, ofrece una gran diversidad de enfoques químicos para la marcación de biomoléculas con 99mTc. Mediante una apropiada selección de la combinación de grupos donadores de electrones es posible lograr buena estabilidad del producto marcado y adecuadas propiedades tanto “in vitro” como “in vivo”. Diversas publicaciones muestran claramente que el uso de distintos enfoques en la marcación afecta fundamentalmente la lipofilicidad de los productos obtenidos y concomitantemente su unión a proteínas plasmáticas, su depuración sanguínea y su excreción renal y hepatobiliar(1,2).

Teniendo en cuenta dichos antecedentes, nuestro trabajo se propuso como objetivo la marcación con 99mTc de un ligando potencialmente bioactivo mediante 2 métodos distintos, formación de complejos 4 +1 de Tc (III) y complejos tricarbonílicos de Tc (I), como mecanismo para modular las propiedades del potencial radiofármaco obtenido.

Los métodos seleccionados han sido utilizados por distintos grupos de investigación en el mundo, con muy buenos resultados. Los dos complejos en estudio fueron obtenidos con adecuada pureza radioquímica, si bien en el caso del complejo 4+1 de Tc(III) fue necesaria una purificación con HPLC para lograrlo. Ambos resultaron sumamente estables tanto en el medio de reacción como cuando fueron enfrentados a sustancias con capacidad de competir por la coordinación del metal. En el caso de las proteínas plasmáticas, existen grupos funcionales de los aminoácidos con buena capacidad donadora de electrones, por lo que pueden desplazar al ligando de su unión con el metal si ésta no es suficientemente fuerte. Lo mismo ocurre con el aminoácido cisteína, cuyos grupos amino, ácido carboxílico y tiol pueden unirse al tecnecio.

Al comparar los resultados de los estudios fisicoquímicos observamos una clara influencia del método de marcación en la lipofilicidad y en la unión a proteínas plasmáticas, tal cual lo esperado. Los valores obtenidos para dichos parámetros nos llevan a anticipar que el complejo de 99mTc-tricarbonílico de tipo “2+1” presente propiedades más favorables para un posible radiofármaco para diagnóstico de hipoxia.

Agradecimientos

El presente trabajo ha sido parcialmente financiado por la Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) y por Pedeciba-Química. Se agradece al Dr. H-J Pietszch y al Dr. H. Cerecetto.

Referencias

  1. Decristoforo C, Santos I, Pietzsch HJ, Duatti A, Smith CJ, Rey A, et al. Comparison of in vitro and in vivo properties of 99mTc-cRGD peptides labelled using different novel Tc-cores. Q J Nucl Med Mol Imaging 2007;51:33-41.
  2. Labelling of small biomolecules using novel Technetium-99m cores. IAEA Technical Report Series 458, IAEA, Vienna, 2007. (http://www-pub.iaea.org/MTCD/publications/PDF/trs459_web.pdf).
  3. Spies H, Glaser M, Pietzsch H-J, Hahn FE, Lügger T. Synthesis and reactions of trigonal-bipyramidal rhenium and technetium complexes with tripodal, tetradentate NS3 ligand. Inorg Chim 1995;Acta 240:465-78.
  4. Pietzsch H-J, Gupta A, Syhre R, Leibnitz P, Spies H. Mixed-ligand technetium(III) complexes with tetradentate/monodentate NS3/isocyanide coordination: A new nonpolar technetium chelate system for the design of neutral and lipophilic complexes stable in vivo. Bioconj Chem 2001;12:538-44.
  5. Alberto R, Schibli R, Waibel A, et al. Basic aqueous chemistry of [M(OH2)3(CO)3]+ (M=Re, Tc) directed towards radiopharmaceutical application. Coord Chem Rev 1999;190:901-19.
  6. Mundwiler S, Kundig M, Ortner K, et al. A new [2+1] mixed ligand concept based on [99(m)Tc(OH2)3(CO)3]+: a basic study. Dalton Trans 2004;7:1320-8.
  7. Giglio J, Fernández S, Cerecetto H, Rey A. Synthesis and biological characterization of novel dithiocarbamate containing 5-nitroimidazole 99mTc-complexes as potential agents for targeting hypoxia. Bioorg Med Chem Letters 2011;21:394-7.